Western實(shí)驗(yàn)步驟

                          Western實(shí)驗(yàn)步驟 
    Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。 
1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation) 
    可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖海绫淘铺焐a(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(P0028)。 
    收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。 
2. 電泳(Electrophoresis) 
(1) SDS-PAGE凝膠配制 
    SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012A)。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。 
(2) 樣品處理 
    在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015)。 
    100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 
(3) 上樣與電泳 
    冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。 
    為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0066)。 
    電泳時(shí)電泳液可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液(P0014A/P0014B)。 
    電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))(EEP102)。為了電泳方便起見(jiàn)，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過(guò)程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90－120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過(guò)頭。
    通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer) 
    我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜(FFP36/FFP39)。硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過(guò)程中特別是用鑷子夾取等過(guò)程中容易裂開(kāi)。膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。 
    通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過(guò)YE。轉(zhuǎn)膜時(shí)也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))(EEP102)。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。
    在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 
    轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液(P0017)對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 
4. 封閉(Blocking) 
    轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液(P0023C)中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。 
    用微型臺(tái)式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液(P0023B)，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉過(guò)ye。在整個(gè)Western過(guò)程中我們推薦使用碧云天的側(cè)擺搖床(ESHK02)或類似儀器，側(cè)向擺動(dòng)速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。 
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 
    參考一抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗。 
    用微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)ye。或更據(jù)抗體的說(shuō)明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間。
    回收一抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。 
    注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，通常可以選用Tubulin抗體(AT819)或Actin抗體(AA128)，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。 
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 
    參考二抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。 二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來(lái)源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多種二抗提供。 
    用微型臺(tái)式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。 
    回收二抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
7. 蛋白檢測(cè)(Detection of proteins) 
    參考相關(guān)說(shuō)明書，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL類試劑來(lái)檢測(cè)蛋白。壓片可以采用的壓片暗盒(FFC58/FFC83)進(jìn)行。 
    洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒(P0019/P0020)自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)柯達(dá)X-OMAT BT膠片(FF057/FF081)。 
8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery) 
    如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。